Синтез тиофосфатных олигонуклеотидов осуществляется на автоматическом синтезаторе амидофосфитным методом с использованием серосодержащего окислителя на стадии окисления. Метод позволяет синтезировать олигонуклеотиды, содержащие фосфотиоатную связь в любом положении олигонуклеотидной цепи. В результате синтеза получается 2n диастереоизомеров (n-число фосфотиоатных связей). Метод ВЭЖХ и гель-электрофореза, используемые для очистки олигонуклеотидов, не позволяют разделить изомеры. Технология синтеза позволяет получать любые количества тиофосфатных олигонуклеотидов. По завершении синтеза олигонуклеотид снимается с полимерного носителя, с него удаляются защитные группы (стадия деблокирования), и далее он подвергается очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ или электрофореза в полиакриламидном геле.

Физико-химические свойства:
Изомеры обладают различными гибридизационными свойствами. Благодаря большему молекулярному весу серы по сравнению с кислородом, тиофосфатные олигонуклеотиды обладают меньшей подвижностью в полиакриламидном геле. Они более гиброфобны и поэтому дольше задерживаются на колонке, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Тиофосфатные олигонуклеотиды плохо фосфорилируются полинуклеотидкиназой (5-10% р32-меченного продукта). Тиофосфатные олигонуклетиды формируют менее прочную двойную спираль с РНК и ДНК, чем их немодифицированные аналоги.